W najnowszym badaniu opublikowanym w Nature Communications naukowcy opracowali nowatorski kandydat na szczepionkę donosową, DelNS1-RBD4N-DAF, dla choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19). Ta żywa atenuowana szczepionka oparta na wektorze wirusa grypy (LAIV) nie posiadała genu białka niestrukturalnego 1 (NS1), ale wyrażała domenę wiążącą receptor (RBD) glikoproteiny kolca (S) ciężkiego ostrego zespołu oddechowego koronawirusa 2 (SARS-CoV-2). Wszystkie stosowane obecnie szczepionki COVID-19, w tym szczepionki zawierające posłany kwas rybonukleinowy (mRNA) i wektor adenowirusowy, zapobiegają progresji do ciężkiej choroby i śmierci po zakażeniu. Mniej jasny jest jednak zakres, w jakim indukują one odporność w górnych drogach oddechowych (URT), gdzie rozpoczyna się zakażenie SARS-CoV-2. Wiele osób, w tym osoby zaszczepione, często zapadają na przełomowe infekcje, co rodzi potrzebę zastosowania alternatywnych metod szczepienia, które mogłyby wzmocnić odporność śluzówkową w górnych drogach oddechowych (URT). Ponieważ SARS-CoV-2 będzie nadal współwystępował z sezonowymi wirusami oddechowymi, np. wirusem grypy, dwufunkcyjna szczepionka dla obu tych wirusów może być bardziej odpowiednia dla ludzi na całym świecie. Będzie ona efektywna kosztowo i zadziała jako skuteczna strategia łagodzenia skutków po pandemii w celu zmniejszenia cyrkulacji SARS-CoV-2 i ewentualnego zaprzestania corocznych epidemii. Tak więc w następnej fazie rozwoju szczepionki COVID-19, wzmocnienie odporności URT byłoby kluczowym celem. Wirus grypy nie był wykorzystywany jako wektor szczepionki, częściowo z powodu jego segmentowanego i zwartego genomu. Jednak po odkryciu mutacji adaptacyjnych w wirusach grypy o zubożonym NS1 (DelNS1), możliwa stała się ich replikacja w zarodkach kurzych i liniach komórkowych ssaków Madin-Darby canine kidney (MDCK). Otworzyło to drogę do opracowania nowych żywych atenuowanych wirusów grypy (LAIV) zwalczających wirusy oddechowe. Donosowe podanie DelNS1-RBD4N-DAF LAIV naśladowało naturalne zakażenie wirusem grypy i dostarczało SARS-CoV-2 RBD (antygen) do URT. Badania kliniczne I/II fazy wykazały, że mutant wirusa zubożonego o NS1 (DelNS1) był doskonałym immunogenem do wyzwalania odporności gospodarza i był niezwykle bezpieczny do stosowania u ludzi. Co więcej, indukował on wysoki poziom interferonu β w zakażonych komórkach, dzięki czemu mógł służyć jako adiuwant wzmacniający odpowiedź immunologiczną przeciwko SARS-CoV-2. W obecnym badaniu naukowcy najpierw sprawdzili, czy włączenie czynnika przyspieszającego rozpad (DAF), genu dla zakotwiczonego w błonie białka, wzmocniło odpowiedzi immunologiczne na domenę wiążącą receptor (RBD) u myszy zaszczepionych szczepionką DelNS1-RBD-DAF LAIV. Zmierzyli więc całkowite immunoglobuliny anty-RBD sześć tygodni po szczepieniu pierwotnym i ich potencjał neutralizacji przeciwko pseudowirusowi wyrażającemu białko SARS-CoV-2 S. Następnie skonstruowali RBD z podstawieniem czterech reszt, tj. A372T, G413N, D428N i P521N, poza motywem wiążącym receptor (RBM), aby skierować je do N-glikozylacji (4N). Postawili oni hipotezę, że osłanianie konkurencyjnych epitopów niebędących enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2), zagnieżdżonych poza RBM, może pomóc w lepszej prezentacji epitopów RBM. To pomogło badaczom ocenić odpowiedzi immunologiczne na RBD i RBD4N u myszy wywołane przez system szczepionek DelNS1-RBD-DAF LAIV. Badane zwierzęta zaszczepili donosowo szczepionkami DelNS1-RBD4N-DAF lub DelNS1-RBD-DAF LAIV, wektorem DelNS1 lub ich wersjami Beta lub Delta. Następnie zmierzyli całkowitą odpowiedź przeciwciał na RBD wirusa typu dzikiego (WT) i linii A. Ponadto, zastosowali test immunoenzymatyczny (ELISA) i testy pseudowirusowe, aby zmierzyć aktywność neutralizującą, odpowiednio. Na koniec badacze porównali immunogenność Beta4N-, Delta4N- i Omi4N-DAFs ze szczepionką mRNA u zwierząt. W tym celu zmierzyli immunoglobulinę A (IgA) przeciwko RBD w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) pobranym od zaszczepionych myszy. Ponadto zmierzyli odpowiedzi komórek T ostrej fazy w płucach i śledzionach myszy dziesięć dni po szczepieniu wspomagającym. Zwierzęta te zaszczepili dwoma dawkami wektora DelNS1 lub DelNS1-RBD4N-DAF zawierającego Delta lub Omicron RBD w odstępie czterech tygodni. W skrócie, zespół analizował odpowiedzi immunologiczne i ochronę przed żywym wyzwaniem SARS-CoV-2 po donosowym podaniu szczepionek DelNS1-RBD4N-DAF u myszy. Ponieważ chomiki są bardziej podatne na zakażenie SARS-CoV-2, stanowią lepszy model zwierzęcy do symulacji klinicznych i patologicznych objawów COVID-19 u ludzi. Dlatego też zespół porównał wyniki uzyskane w modelu mysim z indukcją przeciwciał u chomików po immunizacji prime-boost za pomocą domięśniowego BNT162b2 mRNA lub donosowych szczepionek DelNS1-RBD4N-DAF. W modelach zwierzęcych, system wektorów LAIV wyrażający SARS-CoV-2 RBD z miejsca delecji NS1 (DelNS1-RBD) skutecznie zwiększał ogólnoustrojowe i śluzówkowe odpowiedzi immunologiczne. Połączenie SARS-CoV-2 RBD z krótkim peptydem obejmującym transmembranową i cytoplazmatyczną domenę DAF zapewniło jego przetwarzanie i prezentację na powierzchni komórek zakażonych DelNS1-RBD-DAF LAIV. Włączenie go do prezentacji na powierzchni komórek i selektywna glikozylacja epitopów nie będących konkurencją dlaACE2 w nowym wektorze DelNS1-RBD4N-DAF LAIV dodatkowo zwiększyły jego immunogenność. Western blotting potwierdził wzrost masy cząsteczkowej RBD w miejscach, gdzie badacze zastąpili reszty w celu promowania N-glikozylacji. Co ciekawe, N-glikozylacja zwiększyła również ekspresję RBD w liniach komórkowych ssaków, np. w komórkach MDCK. Tak więc, podczas gdy DAF optymalizował ekspresję RBD na powierzchni komórek, wprowadzenie czterech miejsc N-glikozylacji osłaniało epitopy poza RBM i zachęcało do generowania nAbs specyficznych dla konkurencyjnych epitopów ACE2. RBD Beta i Delta SARS-CoV-2, nazwane Beta4N i Delta4N, indukowały wyższe poziomy nAb niż RBD bez modyfikacji 4N. Testy neutralizacji wykazały zwiększone odpowiedzi nAb przeciwko pseudowirusom wyrażającym białka Beta, Delta i Omicron BA.1 S. Zgodnie z oczekiwaniami, donosowe podanie szczepionki DelNS1-RBD4N-DAF wywołało większą odpowiedź komórek T w płucach niż w śledzionie zaszczepionych myszy, wzmacniając specyficzność szczepienia donosowego wobec URT. Podczas żywego wyzwania SARS-CoV-2, immunizacja szczepionką Delta lub Omicron RBDs opartą na DelNS1-RBD4N-DAF LAIV zapobiegała utracie masy ciała u myszy i chroniła ich tkanki płucne, przy czym wirus był niewykrywalny między drugim a czwartym dniem po zaszczepieniu szczepem przystosowanym do myszy (MA) podwariantu Omicron BA.1. U chomików wszystkie schematy szczepienia wywoływały podobne poziomy przeciwciał anty-RBD, zwłaszcza przeciw przodującemu szczepowi SARS-CoV-2 należącemu do linii A. Natomiast dwie dawki szczepionki Omi4N-DAF nie wywoływały znaczących poziomów przeciwciał neutralizujących (nAbs) przeciwko podwariantom Omicron BA.1 i BA.2. Co istotne, szczepionka DelNS1-RBD4N-DAF LAIV, ale nie BNT162b2, zapobiegała replikacji wariantów SARS-CoV-2, w tym Delta i Omicron BA.2, w tkankach układu oddechowego i zapewniała niemal sterylizującą odporność na zakażenie SARS-CoV-2 u chomików.