W niedawnym badaniu opublikowanym na serwerze preprintów bioRxiv, naukowcy z Holandii ocenili strukturę ludzkiej krążącej immunoglobuliny M (IgM) i jej związek z małym białkiem podobnym do antygenu CD5 (CD5L). Zbadali również rolę CD5L w wiązaniu receptora Fc i aktywacji dopełniacza. IgM jest kluczowym składnikiem odporności zależnej od przeciwciał i jest konserwowana pomimo procesów ewolucyjnych. Wśród izotypów przeciwciał, IgM pojawia się jako pierwsza podczas odpowiedzi immunologicznych. Immunoglobulina M jest multimeryczną cząsteczką białkową o dużych rozmiarach (1,0 MDa), której struktura została opisana jako pentameryczna lub heksameryczna, przy czym ta pierwsza zawiera łańcuch łączący (J). W niniejszym badaniu naukowcy przedefiniowali strukturę serologicznej IgM jako pentamer skompleksowany z CD5L i zawierający łańcuch J. Zespół scharakteryzował CD5L i IgM poprzez śledzenie powiązań i obfitości białek w surowicach uzyskanych od 42 zdrowych dawców. Aby określić ilość łańcuchów białkowych (Igµ, J i CD5L), przeprowadzono oddolną proteomikę z kwantyfikacją bez znakowania. Następnie połączoną surowicę poddano analizie MS metodą chromatografii wykluczania (SEC). W celu ilościowego oznaczenia kompleksów IgM-CD5L przeprowadzono testy immunoenzymatyczne (ELISA). Strukturę krążących IgM analizowano za pomocą fotometrii masowej i spektrometrii mas z detekcją ładunku natywnego (CD MS). Aby zbadać koekspresję IgM i CD5L wśród limfocytów B, hodowano limfocyty B pamięci i naiwne, a następnie analizowano supernatant IgM. W celu zbadania mechanizmów wiązania IgM-CD5L, rekombinowany CD5L (rCD5L) i pentameryczna IgM-J zostały wytworzone in vitro. Aby ocenić rolę cystein C191 i C300 w tworzeniu kompleksów IgM-J-CD5L, wytworzono rekombinowane warianty ludzkiego CD5L (hCD5L) z cysteinami zmutowanymi na seryny i oceniono ich zdolności wiązania IgM-J. Przeprowadzono również analizy przewidywania struktury. Ponadto zbadano funkcjonalne implikacje insercji CD5L do IgM przy użyciu rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych IgM specyficznych dla biotyny i oceniając ich zdolność do indukowania odkładania składnika dopełniacza 3 (C3b) i powodowania lizy biotynylowanych ludzkich erytrocytów. Krążące (serologiczne) IgM istniały wyłącznie jako kompleks pentamerów zawierających łańcuch J, kowalencyjnie związanych z małym białkiem CD5L (36,0 kDa) poprzez CD5L-Cys191. W przeciwieństwie do tego, wydzielnicza IgM w mleku i ślinie nie zawierała CD5L. W przeciwieństwie do IgM, CD5L nie była wydzielana przez limfocyty B, co wskazuje, że CD5L była związana z zewnątrzkomórkową IgM. Odkrycia wykazały, że insercja CD5L w IgM miała kilka konsekwencji funkcjonalnych, tj. zmniejszała wiązanie IgM z dwoma receptorami, polimerycznym receptorem Ig (pIgR) i FcαµR. Natomiast integracja CD5L i IgM nie miała wpływu na wiązanie FcµR i dopełniacza leczonego C1q. CD5L występował synchronicznie z IgM w krążeniu. Zespół wykrył średnie stężenie serologiczne CD5L wynoszące 1,70 µM lub 60,0 mg/l. Co ciekawe, poziomy CD5L silnie korelowały z poziomami stałego regionu łańcucha ciężkiego IgM (IgµC), wskazując na wysoki poziom krążących kompleksów IgM-CD5L. Co więcej, stosunek CD5L/IgµC wynosił około 0,2, blisko jednej cząsteczki CD5L na pentamer IgM. Krążąca IgM była głównie pentamerem połączonym łańcuchem J z CD5L. Związane z IgM poziomy CD5L i całkowitej IgM korelowały w próbkach serologicznych, wskazując, że krążące IgM istniały w postaci złożonej z CD5L. We wszystkich próbkach krążących IgM zaobserwowano przesunięcia ściśle odpowiadające przyłączeniu cząsteczki CD5L w stosunku 1:1:10 CD5L:łańcuch J:IgµC. Każda cząsteczka IgM miała jednorodną masę i stan oligomeryczny. Skuteczne asocjacje IgM-rCD5L zaobserwowano w warunkach łagodnej redukcji, co wskazuje, że wiązania disiarczkowe łączące = CD5L i IgM są krytyczne dla tworzenia kompleksów. Tworzenie kompleksów IgM-CD5L zostało zweryfikowane przez ekranowanie epitopu CD5L przez dwa przeciwciała monoklonalne anty-CD5L (mAbs, 7E4 i 10D11), które nie mogą wiązać się z serologiczną IgM. Podstawienie aminokwasu C191S znacznie zmniejszyło tworzenie kompleksów, podczas gdy podstawienie C300S nie, co wskazuje, że C191 może być połączony z IgM wiązaniami disiarczkowymi. CD5L był umieszczony w pentamerycznej szczelinie IgM-Fc, a domena składnika wydzielniczego 3 (SRC3) znajdowała się proksymalnie do połączenia łańcucha między pętlami C- i N-końcowymi łańcucha J. SRC2 znajdowała się na szczycie przegrody oddzielającej domeny Fc-Cμ3 i Fc-Cμ4 N-końca łańcucha J, pozycjonując C191 w pobliżu niesparowanej reszty cysteiny 414 (Cys414) IgM, a SRC1 była elastyczna. CD5L-J-IgM równoważnie aktywowały dopełniacz, a przeciwciała rIgM-J, z lub bez CF5L, indukowały lizę komórek i odkładanie C3b w porównywalnych ilościach. Podobnie, badanie wpływu CD5L na odkładanie składnika dopełniacza 3 przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się z glikopolimerem ściany komórkowej Staphylococcus aureus, kwasem teichoinowym, dało podobne wyniki. W oparciu o wyniki badań, kanoniczną formą ludzkiej serologicznej IgM jest pentamer połączony łańcuchem J z jedną cząsteczką białka CD5L.