Holenderscy naukowcy ujawniają integralną rolę białka CD5L w strukturze i funkcji IgM

W niedawnym badaniu opublikowanym na serwerze preprintów bioRxiv, naukowcy z Holandii ocenili strukturę ludzkiej krążącej immunoglobuliny M (IgM) i jej związek z małym białkiem podobnym do antygenu CD5 (CD5L). Zbadali również rolę CD5L w wiązaniu receptora Fc i aktywacji dopełniacza. IgM jest kluczowym składnikiem odporności zależnej od przeciwciał i jest konserwowana pomimo procesów ewolucyjnych. Wśród izotypów przeciwciał, IgM pojawia się jako pierwsza podczas odpowiedzi immunologicznych. Immunoglobulina M jest multimeryczną cząsteczką białkową o dużych rozmiarach (1,0 MDa), której struktura została opisana jako pentameryczna lub heksameryczna, przy czym ta pierwsza zawiera łańcuch łączący (J). W niniejszym badaniu naukowcy przedefiniowali strukturę serologicznej IgM jako pentamer skompleksowany z CD5L i zawierający łańcuch J. Zespół scharakteryzował CD5L i IgM poprzez śledzenie powiązań i obfitości białek w surowicach uzyskanych od 42 zdrowych dawców. Aby określić ilość łańcuchów białkowych (Igµ, J i CD5L), przeprowadzono oddolną proteomikę z kwantyfikacją bez znakowania. Następnie połączoną surowicę poddano analizie MS metodą chromatografii wykluczania (SEC). W celu ilościowego oznaczenia kompleksów IgM-CD5L przeprowadzono testy immunoenzymatyczne (ELISA). Strukturę krążących IgM analizowano za pomocą fotometrii masowej i spektrometrii mas z detekcją ładunku natywnego (CD MS). Aby zbadać koekspresję IgM i CD5L wśród limfocytów B, hodowano limfocyty B pamięci i naiwne, a następnie analizowano supernatant IgM. W celu zbadania mechanizmów wiązania IgM-CD5L, rekombinowany CD5L (rCD5L) i pentameryczna IgM-J zostały wytworzone in vitro. Aby ocenić rolę cystein C191 i C300 w tworzeniu kompleksów IgM-J-CD5L, wytworzono rekombinowane warianty ludzkiego CD5L (hCD5L) z cysteinami zmutowanymi na seryny i oceniono ich zdolności wiązania IgM-J. Przeprowadzono również analizy przewidywania struktury. Ponadto zbadano funkcjonalne implikacje insercji CD5L do IgM przy użyciu rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych IgM specyficznych dla biotyny i oceniając ich zdolność do indukowania odkładania składnika dopełniacza 3 (C3b) i powodowania lizy biotynylowanych ludzkich erytrocytów. Krążące (serologiczne) IgM istniały wyłącznie jako kompleks pentamerów zawierających łańcuch J, kowalencyjnie związanych z małym białkiem CD5L (36,0 kDa) poprzez CD5L-Cys191. W przeciwieństwie do tego, wydzielnicza IgM w mleku i ślinie nie zawierała CD5L. W przeciwieństwie do IgM, CD5L nie była wydzielana przez limfocyty B, co wskazuje, że CD5L była związana z zewnątrzkomórkową IgM. Odkrycia wykazały, że insercja CD5L w IgM miała kilka konsekwencji funkcjonalnych, tj. zmniejszała wiązanie IgM z dwoma receptorami, polimerycznym receptorem Ig (pIgR) i FcαµR. Natomiast integracja CD5L i IgM nie miała wpływu na wiązanie FcµR i dopełniacza leczonego C1q. CD5L występował synchronicznie z IgM w krążeniu. Zespół wykrył średnie stężenie serologiczne CD5L wynoszące 1,70 µM lub 60,0 mg/l. Co ciekawe, poziomy CD5L silnie korelowały z poziomami stałego regionu łańcucha ciężkiego IgM (IgµC), wskazując na wysoki poziom krążących kompleksów IgM-CD5L. Co więcej, stosunek CD5L/IgµC wynosił około 0,2, blisko jednej cząsteczki CD5L na pentamer IgM. Krążąca IgM była głównie pentamerem połączonym łańcuchem J z CD5L. Związane z IgM poziomy CD5L i całkowitej IgM korelowały w próbkach serologicznych, wskazując, że krążące IgM istniały w postaci złożonej z CD5L. We wszystkich próbkach krążących IgM zaobserwowano przesunięcia ściśle odpowiadające przyłączeniu cząsteczki CD5L w stosunku 1:1:10 CD5L:łańcuch J:IgµC. Każda cząsteczka IgM miała jednorodną masę i stan oligomeryczny. Skuteczne asocjacje IgM-rCD5L zaobserwowano w warunkach łagodnej redukcji, co wskazuje, że wiązania disiarczkowe łączące = CD5L i IgM są krytyczne dla tworzenia kompleksów. Tworzenie kompleksów IgM-CD5L zostało zweryfikowane przez ekranowanie epitopu CD5L przez dwa przeciwciała monoklonalne anty-CD5L (mAbs, 7E4 i 10D11), które nie mogą wiązać się z serologiczną IgM. Podstawienie aminokwasu C191S znacznie zmniejszyło tworzenie kompleksów, podczas gdy podstawienie C300S nie, co wskazuje, że C191 może być połączony z IgM wiązaniami disiarczkowymi. CD5L był umieszczony w pentamerycznej szczelinie IgM-Fc, a domena składnika wydzielniczego 3 (SRC3) znajdowała się proksymalnie do połączenia łańcucha między pętlami C- i N-końcowymi łańcucha J. SRC2 znajdowała się na szczycie przegrody oddzielającej domeny Fc-Cμ3 i Fc-Cμ4 N-końca łańcucha J, pozycjonując C191 w pobliżu niesparowanej reszty cysteiny 414 (Cys414) IgM, a SRC1 była elastyczna. CD5L-J-IgM równoważnie aktywowały dopełniacz, a przeciwciała rIgM-J, z lub bez CF5L, indukowały lizę komórek i odkładanie C3b w porównywalnych ilościach. Podobnie, badanie wpływu CD5L na odkładanie składnika dopełniacza 3 przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się z glikopolimerem ściany komórkowej Staphylococcus aureus, kwasem teichoinowym, dało podobne wyniki. W oparciu o wyniki badań, kanoniczną formą ludzkiej serologicznej IgM jest pentamer połączony łańcuchem J z jedną cząsteczką białka CD5L.

Zdrowie psychiczne ma głęboki wpływ na reakcje zapalne w organizmie

Ostatnie badanie opublikowane w Cell Journal ujawniło mechanizmy, dzięki którym stres psychologiczny wpływa na stan zapalny jelit. Stres psychologiczny ma ogromny wpływ na reakcje zapalne. Wpływ stresu psychologicznego na nasilenie choroby jest szczególnie zauważalny w nieswoistym zapaleniu jelit (IBD). Różne badania epidemiologiczne potwierdzają, że stresujące wydarzenia mogą nasilać zaostrzenia IBD. Mimo to mechanistyczne podstawy zaostrzenia IBD związanego ze stresem są mniej zrozumiałe. W niniejszym badaniu naukowcy zbadali mechanizmy leżące u podstaw wpływu stresu psychologicznego na zapalenie jelit. Po pierwsze, wywołali zapalenie jelita grubego w mysim modelu przewlekłego stresu (stres powściągliwości) i zaobserwowali zaostrzenie stanu zapalnego jelit. Sekwencjonowanie RNA ujawniło uderzające zmiany w ekspresji genów. Geny związane z odpornością typu 2 i peptydami przeciwdrobnoustrojowymi uległy zmniejszeniu, podczas gdy geny związane z IBD i cytokiny prozapalne uległy zwiększeniu. Warto zauważyć, że stres doświadczony przed wystąpieniem zapalenia jelita grubego miał najsilniejszy wpływ na zaostrzenie stanu zapalnego. Sugeruje to, że stres może wstępnie przygotować jelito do nasilonej odpowiedzi zapalnej podczas kolejnych spotkań z wyzwalaczem kolitogennym. Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek ponad 23 000 klastrów różnicowania 45-dodatnich (CD45 +) leukocytów z tkanki okrężnicy myszy kontrolnych i zestresowanych zidentyfikowało 13 unikalnych typów komórek odpornościowych. U myszy poddanych stresowi, komórki T, wrodzone komórki limfoidalne oraz monocyty lub makrofagi miały najwyższą ekspresję genów. Co więcej, zespół odkrył, że wrodzone lub adaptacyjne limfocyty nie napędzały odpowiedzi zapalnej jelit na stres. Dlatego badacze skupili się na komórkach szpikowych, zwłaszcza makrofagach i monocytach. Subklasteryzacja danych ujawniła trzy podgrupy monocytów (Mono 1-3) i dwa podgrupy makrofagów (Mac 1-2). Analiza trajektorii pseudo-czasowej wykazała akumulację monocytów u myszy poddanych stresowi. Pozbawienie myszy monocytów 2-dodatnich receptorów chemokinowych z motywem C (CCR2+) chroniło je przed zaostrzeniem zapalenia jelita grubego wywołanym stresem. Co więcej, monocyty wytwarzające czynnik martwicy nowotworów (TNF) były silnie gromadzone w okrężnicy zestresowanych myszy. Neutralizacja TNF za pomocą przeciwciała monoklonalnego (mAb) chroniła myszy przed skutkami stresu. Następnie naukowcy prześledzili przenoszenie stresu psychologicznego z mózgu do jelit. Stres u myszy znacznie zwiększył poziom kortykosteronu i noradrenaliny w surowicy. Zespół zahamował indukowane przez mózg uwalnianie kortykosteronu nadnerczowego, co zmniejszyło poziom kortykosteronu i sprawiło, że myszy stały się odporne na wpływ stresu na zapalenie jelita grubego. Podobnie, adrenalektomia lub hamowanie sygnalizacji receptora glukokortykoidowego (GR) zapobiegało zaostrzeniu zapalenia jelita grubego wywołanego stresem. Naukowcy spekulowali, że sygnalizacja GR w komórkach szpikowych była odpowiedzialna za wpływ stresu na IBD. Niemniej jednak, myszy bez genu GR, receptora jądrowego podrodziny 3 grupy C członka 1 (Nr3c1), w komórkach szpikowych były podatne na efekty stresu podobne do ich miotów kontrolnych, co sugeruje pośredni wpływ glukokortykoidów na monocyty. Następnie zespół zbadał, czy przewlekły stres psychologiczny wpływa na komórki jelitowego układu nerwowego (ENS). W tym celu usunięto Nr3c1 z neuronów jelitowych i gleju. Chroniło to myszy przed wpływem zapalenia jelita grubego wywołanego stresem i zapobiegało gromadzeniu się monocytów. Odkrycia te wspólnie sugerowały, że ENS może być przekaźnikiem między glukokortykoidami a odpowiedzią zapalną jelit. Następnie przeprowadzono sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder neuronów jelitowych i gleju oraz zidentyfikowano jednolite klastry aproksymacji i projekcji (UMAP). Analiza podklastrów ujawniła cztery unikalne stany transkrypcyjne. Jeden stan, określany jako glej jelitowy związany ze stresem psychologicznym (eGAPS), występował wyłącznie w stresujących warunkach. Myszy pozbawione gleju jelitowego były odporne na wpływ stresu na zapalenie jelita grubego. Co więcej, ablacja gleju zapobiegała również gromadzeniu się monocytów w okrężnicy. Następnie zespół wygenerował i przeanalizował mapę interakcji parami opartą na transkryptomach pojedynczych jąder i pojedynczych komórek, która wykazała kilka hipotetycznych interakcji między komórkami mieloidalnymi okrężnicy a eGAPS. Zespół skupił się na interakcjach między klastrem Mono1 a eGAPS ze względu na wysoką ekspresję Tnf w tych monocytach. Czynnik stymulujący kolonie 1 (Csf1) był jednym z mediatorów tej interakcji. Co więcej, ekspresja Csf1 była podwyższona w gleju jelitowym pod wpływem stresu. Wysoka ekspresja Csf1 w okrężnicy zależała od sygnalizacji ENS GR, ponieważ delecja Nr3c1 osłabiła indukcję Csf1 pod wpływem stresu. Neutralizacja białka CSF1 za pomocą mAb nadawała odporność na wpływ stresu na zapalenie okrężnicy. Następnie naukowcy zbadali przedział neuronów w zestawie danych ENS pojedynczego jądra. Nitrergiczne i cholinergiczne podgrupy dojrzałych neuronów były niedostatecznie reprezentowane w zestresowanej grupie, podczas gdy prekursory były wzbogacone. Sugerowało to, że stres zwiększał liczbę neuronów podobnych do prekursorów, jednocześnie zmniejszając liczbę dojrzałych neuronów. Dalsze eksperymenty sugerowały, że stres wywołał przejście w kierunku mniej zróżnicowanego fenotypu i zmniejszył liczbę neuronów cholinergicznych i nitrergicznych, prowadząc do dysmotyczności. Porównano profile ekspresji niedojrzałych i dojrzałych neuronów jelitowych. Gen transformującego czynnika wzrostu beta 2 (Tgfb2) był istotnie związany ze stanem prekursorowym. Zastosowanie przeciwciała neutralizującego TGF-β zapobiegło przejściu i przywróciło ruchliwość jelit u zestresowanych myszy. Wreszcie, naukowcy zbadali związek między stresem psychologicznym, stanem zapalnym jelit i zaburzeniami motoryki u pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit. Pacjenci z wysokim przewlekłym stresem psychologicznym byli narażeni na znacznie podwyższone ryzyko rozwoju IBD w porównaniu z osobami bez stresu. Stres psychologiczny był również powiązany z cięższym przebiegiem IBD po diagnozie. Leukocyty, w tym monocyty, były podwyższone u zestresowanych pacjentów. Pacjenci zestresowani częściej zgłaszali niezadowolenie z nawyków jelitowych i zaparcia, rozwijali niedrożność jelit i wymagali operacji. Zespół zbadał, czy zmiany te były ogólne, czy specyficzne dla pacjentów z IBD. Przebadano populacje w United Kingdom (UK) Biobank, które były wolne od choroby lub pacjentów z zespołem jelita drażliwego lub chorobą pozajelitową (reumatoidalne zapalenie stawów). Okazało się, że zaburzenia motoryki były związane ze stresem we wszystkich populacjach, ale podwyższone markery stanu zapalnego i akumulacja monocytów były obserwowane tylko w kontekście choroby jelit.