W najnowszej pracy opublikowanej w czasopiśmie PLOS One naukowcy przedstawiają strukturę krystaliczną nanobiałka specyficznego dla białka 9 (nsp) w kompleksie z koronawirusem 2 (SARS-CoV-2) o ciężkim ostrym zespole oddechowym (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) nsp9, którą określili jako nsp9COV19. Nsp9 jest małym czynnikiem akcesorycznym, który odgrywa kluczową rolę w kompleksie replikacyjnym i transkrypcyjnym koronawirusa (CoV) (RTC). Ponadto, nsp9 kojarzy się z N-końcową pseudokinazą Nidovirales ribonucleic acid (RNA)-dependent RNA polymerase (RdRp) associated nucleotidyltransferase domain (NiRAN) of nsp12, która jest produkowana wewnątrz komórek gospodarza jako samorozpadająca się poliproteina PP1ab. Nsp12 zawiera istotną wirusową RdRp, która wraz z nsp7 i nsp8 staje się podstawową składową RTC. Nsp9 posiada odrębną fałdę wirusową, białko wiążące RNA oraz kluczowy element dla kappingu wirusowego messenger RNA (mRNA). Białko to rekrutuje również inne białka do kappingu wirusowego 5'-mRNA, co jest istotnym aspektem replikacji wirusowej, co czyni nsp12 potencjalnie realnym celem terapeutycznym. W modelu kappingu SARS-CoV-2, domena nsp9 i NiRAN działają wspólnie jako polirybonukleotydylotransferaza (PRNTase) z resztami katalitycznymi i akceptującymi addukty na różnych łańcuchach aminokwasowych. VHHs to pochodzące od wielbłądów immunoglobuliny (Ig) nanobody ze zmiennymi ciężkimi domenami. Poprzednie badania wykazały, że te nanobody mogą być wysoce specyficzne dla nsp9. Podobnie, w kilku badaniach zidentyfikowano wiele małych cząsteczek z powinowactwem do nsp9COV19 i potencjałem do hamowania zaangażowania NiRAN, a w rezultacie do zapobiegania RNAylacji i kappingu SARS-CoV-2. W obecnym badaniu badacze opisują elastyczność nsp9. W tym celu nsp9 i kompleks anty-nsp9 VHH2nsp23 zostały oczyszczone i współkomponowane na drodze filtracji żelowej. Następnie zbadano strukturę krystaliczną tego kompleksu w rozdzielczości 2,4Å za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej. Po wielu rundach zespół ostatecznie zbudował i udoskonalił strukturę krystaliczną VHH2nsp23-bound state of nsp9COV19, która posiadała dwie kopie kompleksu nsp9COV19: VHH2nsp23 w obrębie nakładki jednostki asymetrycznej. Stwierdzono, że białko związane z transformacją 53 (Trp-53) jest podstawową cechą rozległego interfejsu wiążącego przeciwciała z nsp9COV19, w którym pętla CDR3 tworzyła rozszerzone oddziaływanie w postaci arkusza β. Wiązanie nanoobiektów wywołało wielkoskalowe zmiany topologiczne w unikalnym fałdzie koronawirusowym nsp9, które zniekształciły wszystkie elementy nsp9 oddziałujące z NiRAN. Jednak pozostaje niejasne, czy wiązanie VHH sztucznie wywołało ten stan wiązania, czy też był to alternatywny, istniejący wcześniej stan strukturalny lub pośredni etap fałdowania, który pozostał uwięziony wewnątrz nsp9. Wykres Kleywegt został użyty do zbadania potencjalnych punktów elastyczności w obrębie fałdu nsp9 i porównania związanych i niezwiązanych stanów nsp9COV19. Mapowano również odległości Ramachandrana pomiędzy każdym stanem na strukturę nsp9COV19. Miejsce wiązania VHH2nsp23 na nsp9COV19 było rozległe, w którym reszty w obrębie pętli VHHCDR2 i VHHCDR3 stanowiły odpowiednio 27% i 66% interfejsu wiążącego. Reszty VHHCDR3 103YYFST107 biegły antyrównolegle do s5-strandu nsp9COV19 i tworzyły cztery β-szkieletowe wiązania wodorowe (H). Reszty te tworzyły również oddziaływania szkielet-boczek z VHHThr-107. Dodatkowo, pętla VHHCDR2 w VHH2nsp23 przyczyniła się do znacznych kontaktów, które były całkowicie pośredniczone przez łańcuch szkieletowy. Trp-53 z nsp9COV19 był zaciśnięty między VHHMet-50 i VHHIle-52, z których obie są resztami hydrofobowymi. Razem osiem specyficznych dla epitopu wiązań H, wiele oddziaływań van der Waalsa i jeden mostek solny przyczyniły się do antynsp9COV19-specyficzności VHH2nsp23. Po związaniu VHH autorzy zauważyli, że natywna nieligandowana forma nsp9COV19 uległa pewnym rearanżacjom strukturalnym. W tym celu zaobserwowano repozycjonowanie helisy α spoza mini β-beczki i pomiędzy pętlami s2-s3 i s4-s5 oddalonymi od siebie o 30Å. Niemniej jednak, większość elementów β-struktury nsp9COV19 pozostała topologicznie w pobliżu w stanie związanym. Zidentyfikowano również inne punkty strukturalne w obrębie fałdu nsp9, które mogą służyć jako punkty przegubowe. Na przykład Leu-42, w stanie związanym z VHH2nsp23, znajdował się i tworzył standardową prostą nić β, podczas gdy w stanie apo, Leu-42 znajdował się w punkcie przegubowym, umożliwiając w ten sposób s3 odwrócenie się od αC. Przemieszczanie się αC na dużą skalę było głównie ułatwione przez przesunięcia szkieletowe w resztach Lys-92/Gly-93, z którymi bezpośrednio kontaktował się VHH2nsp23. Podczas wirusowego 5' mRNA-cappingu, N-końcówka nsp9COV19 wstawia się do domeny nsp12 NiRAN, w czym pośredniczą cechy fałdu apo-nsp9. Cechy te obejmują motyw interakcji GxxxG i N-końcówkę wystającą do miejsca aktywnego.
