W ramach badania opracowano nową donosową szczepionkę zawierającą wirus grypy przeciwko SARS-CoV-2

W najnowszym badaniu opublikowanym w Nature Communications naukowcy opracowali nowatorski kandydat na szczepionkę donosową, DelNS1-RBD4N-DAF, dla choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19). Ta żywa atenuowana szczepionka oparta na wektorze wirusa grypy (LAIV) nie posiadała genu białka niestrukturalnego 1 (NS1), ale wyrażała domenę wiążącą receptor (RBD) glikoproteiny kolca (S) ciężkiego ostrego zespołu oddechowego koronawirusa 2 (SARS-CoV-2). Wszystkie stosowane obecnie szczepionki COVID-19, w tym szczepionki zawierające posłany kwas rybonukleinowy (mRNA) i wektor adenowirusowy, zapobiegają progresji do ciężkiej choroby i śmierci po zakażeniu. Mniej jasny jest jednak zakres, w jakim indukują one odporność w górnych drogach oddechowych (URT), gdzie rozpoczyna się zakażenie SARS-CoV-2. Wiele osób, w tym osoby zaszczepione, często zapadają na przełomowe infekcje, co rodzi potrzebę zastosowania alternatywnych metod szczepienia, które mogłyby wzmocnić odporność śluzówkową w górnych drogach oddechowych (URT). Ponieważ SARS-CoV-2 będzie nadal współwystępował z sezonowymi wirusami oddechowymi, np. wirusem grypy, dwufunkcyjna szczepionka dla obu tych wirusów może być bardziej odpowiednia dla ludzi na całym świecie. Będzie ona efektywna kosztowo i zadziała jako skuteczna strategia łagodzenia skutków po pandemii w celu zmniejszenia cyrkulacji SARS-CoV-2 i ewentualnego zaprzestania corocznych epidemii. Tak więc w następnej fazie rozwoju szczepionki COVID-19, wzmocnienie odporności URT byłoby kluczowym celem. Wirus grypy nie był wykorzystywany jako wektor szczepionki, częściowo z powodu jego segmentowanego i zwartego genomu. Jednak po odkryciu mutacji adaptacyjnych w wirusach grypy o zubożonym NS1 (DelNS1), możliwa stała się ich replikacja w zarodkach kurzych i liniach komórkowych ssaków Madin-Darby canine kidney (MDCK). Otworzyło to drogę do opracowania nowych żywych atenuowanych wirusów grypy (LAIV) zwalczających wirusy oddechowe. Donosowe podanie DelNS1-RBD4N-DAF LAIV naśladowało naturalne zakażenie wirusem grypy i dostarczało SARS-CoV-2 RBD (antygen) do URT. Badania kliniczne I/II fazy wykazały, że mutant wirusa zubożonego o NS1 (DelNS1) był doskonałym immunogenem do wyzwalania odporności gospodarza i był niezwykle bezpieczny do stosowania u ludzi. Co więcej, indukował on wysoki poziom interferonu β w zakażonych komórkach, dzięki czemu mógł służyć jako adiuwant wzmacniający odpowiedź immunologiczną przeciwko SARS-CoV-2. W obecnym badaniu naukowcy najpierw sprawdzili, czy włączenie czynnika przyspieszającego rozpad (DAF), genu dla zakotwiczonego w błonie białka, wzmocniło odpowiedzi immunologiczne na domenę wiążącą receptor (RBD) u myszy zaszczepionych szczepionką DelNS1-RBD-DAF LAIV. Zmierzyli więc całkowite immunoglobuliny anty-RBD sześć tygodni po szczepieniu pierwotnym i ich potencjał neutralizacji przeciwko pseudowirusowi wyrażającemu białko SARS-CoV-2 S. Następnie skonstruowali RBD z podstawieniem czterech reszt, tj. A372T, G413N, D428N i P521N, poza motywem wiążącym receptor (RBM), aby skierować je do N-glikozylacji (4N). Postawili oni hipotezę, że osłanianie konkurencyjnych epitopów niebędących enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2), zagnieżdżonych poza RBM, może pomóc w lepszej prezentacji epitopów RBM. To pomogło badaczom ocenić odpowiedzi immunologiczne na RBD i RBD4N u myszy wywołane przez system szczepionek DelNS1-RBD-DAF LAIV. Badane zwierzęta zaszczepili donosowo szczepionkami DelNS1-RBD4N-DAF lub DelNS1-RBD-DAF LAIV, wektorem DelNS1 lub ich wersjami Beta lub Delta. Następnie zmierzyli całkowitą odpowiedź przeciwciał na RBD wirusa typu dzikiego (WT) i linii A. Ponadto, zastosowali test immunoenzymatyczny (ELISA) i testy pseudowirusowe, aby zmierzyć aktywność neutralizującą, odpowiednio. Na koniec badacze porównali immunogenność Beta4N-, Delta4N- i Omi4N-DAFs ze szczepionką mRNA u zwierząt. W tym celu zmierzyli immunoglobulinę A (IgA) przeciwko RBD w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) pobranym od zaszczepionych myszy. Ponadto zmierzyli odpowiedzi komórek T ostrej fazy w płucach i śledzionach myszy dziesięć dni po szczepieniu wspomagającym. Zwierzęta te zaszczepili dwoma dawkami wektora DelNS1 lub DelNS1-RBD4N-DAF zawierającego Delta lub Omicron RBD w odstępie czterech tygodni. W skrócie, zespół analizował odpowiedzi immunologiczne i ochronę przed żywym wyzwaniem SARS-CoV-2 po donosowym podaniu szczepionek DelNS1-RBD4N-DAF u myszy. Ponieważ chomiki są bardziej podatne na zakażenie SARS-CoV-2, stanowią lepszy model zwierzęcy do symulacji klinicznych i patologicznych objawów COVID-19 u ludzi. Dlatego też zespół porównał wyniki uzyskane w modelu mysim z indukcją przeciwciał u chomików po immunizacji prime-boost za pomocą domięśniowego BNT162b2 mRNA lub donosowych szczepionek DelNS1-RBD4N-DAF. W modelach zwierzęcych, system wektorów LAIV wyrażający SARS-CoV-2 RBD z miejsca delecji NS1 (DelNS1-RBD) skutecznie zwiększał ogólnoustrojowe i śluzówkowe odpowiedzi immunologiczne. Połączenie SARS-CoV-2 RBD z krótkim peptydem obejmującym transmembranową i cytoplazmatyczną domenę DAF zapewniło jego przetwarzanie i prezentację na powierzchni komórek zakażonych DelNS1-RBD-DAF LAIV. Włączenie go do prezentacji na powierzchni komórek i selektywna glikozylacja epitopów nie będących konkurencją dlaACE2 w nowym wektorze DelNS1-RBD4N-DAF LAIV dodatkowo zwiększyły jego immunogenność. Western blotting potwierdził wzrost masy cząsteczkowej RBD w miejscach, gdzie badacze zastąpili reszty w celu promowania N-glikozylacji. Co ciekawe, N-glikozylacja zwiększyła również ekspresję RBD w liniach komórkowych ssaków, np. w komórkach MDCK. Tak więc, podczas gdy DAF optymalizował ekspresję RBD na powierzchni komórek, wprowadzenie czterech miejsc N-glikozylacji osłaniało epitopy poza RBM i zachęcało do generowania nAbs specyficznych dla konkurencyjnych epitopów ACE2. RBD Beta i Delta SARS-CoV-2, nazwane Beta4N i Delta4N, indukowały wyższe poziomy nAb niż RBD bez modyfikacji 4N. Testy neutralizacji wykazały zwiększone odpowiedzi nAb przeciwko pseudowirusom wyrażającym białka Beta, Delta i Omicron BA.1 S. Zgodnie z oczekiwaniami, donosowe podanie szczepionki DelNS1-RBD4N-DAF wywołało większą odpowiedź komórek T w płucach niż w śledzionie zaszczepionych myszy, wzmacniając specyficzność szczepienia donosowego wobec URT. Podczas żywego wyzwania SARS-CoV-2, immunizacja szczepionką Delta lub Omicron RBDs opartą na DelNS1-RBD4N-DAF LAIV zapobiegała utracie masy ciała u myszy i chroniła ich tkanki płucne, przy czym wirus był niewykrywalny między drugim a czwartym dniem po zaszczepieniu szczepem przystosowanym do myszy (MA) podwariantu Omicron BA.1. U chomików wszystkie schematy szczepienia wywoływały podobne poziomy przeciwciał anty-RBD, zwłaszcza przeciw przodującemu szczepowi SARS-CoV-2 należącemu do linii A. Natomiast dwie dawki szczepionki Omi4N-DAF nie wywoływały znaczących poziomów przeciwciał neutralizujących (nAbs) przeciwko podwariantom Omicron BA.1 i BA.2. Co istotne, szczepionka DelNS1-RBD4N-DAF LAIV, ale nie BNT162b2, zapobiegała replikacji wariantów SARS-CoV-2, w tym Delta i Omicron BA.2, w tkankach układu oddechowego i zapewniała niemal sterylizującą odporność na zakażenie SARS-CoV-2 u chomików.

Mechanizmy nerwowe powodujące długotrwałe zmęczenie spowodowane COVID-19

W najnowszym badaniu opublikowanym w Brain Communications Journal, naukowcy zbadali mechanizmy neuronalne leżące u podstaw zmęczenia po chorobie koronawirusowej (COVID) (pCF). Objawy COVID 2019 (COVID-19) mogą utrzymywać się poza ostrą fazą choroby [określane jako długi COVID lub stan po COVID-19 (PCC)]. Tacy pacjenci często prezentują zmęczenie, objaw, który wpływa na wykonywanie rutynowych czynności. Wydaje się, że zmęczenie dotyczy wielu układów, powodując zaburzenia immunologiczne, hormonalne i metaboliczne, szczególnie wpływając na funkcje neurokognitywne i prowadząc do uczucia osłabienia. Patofizjologia długiego zmęczenia COVID nie jest jednak dobrze scharakteryzowana i wymaga dalszych badań. W obecnym badaniu przekrojowym naukowcy badali patofizjologię zmęczenia w fazie po ostrej infekcji zespołu ostrej niewydolności oddechowej koronawirusem 2 (SARS-CoV-2). Do badania włączono 37 osób dorosłych, w wieku ≤65,0 lat, zgłaszających zmęczenie od sześciu do 26 tygodni po łagodnym zakażeniu SARS-CoV-2 i bez wcześniejszej historii chorób neurologicznych. Dla porównania włączono 52 dobrane pod względem płci i wieku osoby bez zmęczenia (kontrole), wśród których sześć osób przebyło łagodne COVID-19 i wyzdrowiało po nim bez pCF. Wykonano kilka nieinwazyjnych testów neurofizjologicznych i behawioralnych oceniających autonomiczny (ANS), ośrodkowy (CNS) i obwodowy układ nerwowy (PNS), a następnie przeprowadzono analizę skupień K-means i analizę luk. Przezczaszkową stymulację magnetyczną (TMS) przeprowadzono w celu oceny funkcji pierwotnej kory ruchowej, a nerwy czuciowe stymulowano w celu oceny dysfunkcji w sprzężeniu zwrotnym obwodów czuciowych do OUN. Ponadto, mięśnie były stymulowane elektrycznie, aby ocenić poziom zmęczenia obwodowego i centralnego, a częstość akcji serca (HR) i galwaniczne odpowiedzi skórne były rejestrowane w celu oceny funkcji ANS. Ponadto wykonano elektromiografię powierzchniową o dużej gęstości w celu oceny aktywności jednostek motorycznych mięśni, z której uzyskano metryki systemu neuromodulacyjnego. Dodatkowo, uczestnicy wypełniali kwestionariusze online w skali wpływu zmęczenia (FIS), a klasyfikator oparty na uczeniu maszynowym został wykorzystany do zaklasyfikowania osób do grupy pacjentów z pCF i do grupy kontrolnej przy użyciu danych wielozmiennych. Wśród uczestników badania 73% (n=27) i 71% (n=37) osób z pCF i grupy kontrolnej stanowiły kobiety. W porównaniu z dobranymi pod względem płci i wieku osobami z grupy kontrolnej, pacjenci z długim COVID doświadczający zmęczenia wykazywali niedostateczną aktywność w poszczególnych obwodach korowych, dysregulację funkcji autonomicznych oraz zmiany miopatyczne w mięśniach szkieletowych. Natomiast nieprawidłowości w zakresie funkcji sensorycznych i zstępującego napędu neuromodulacyjnego raczej nie przyczyniały się do powstania pCF. Ponadto nie znaleziono żadnych podgrup, co wskazuje, że długie zmęczenie COVID jest odrębną jednostką z różnicami na poziomie indywidualnym, a nie kombinacją różnych zespołów. Średni wynik FIS wśród pacjentów z pCF wynosił 83, co wskazuje, że zmęczenie umiarkowanie wpływało na codzienne życie. Czas pomiędzy diagnozą COVID-19 a badaniem laboratoryjnym na obecność SARS-CoV-2 wynosił 121 dni. Nie zaobserwowano korelacji między nasileniem zmęczenia a dniami, które upłynęły od zakażenia SARS-CoV-2. Na podstawie wcześniej opublikowanych względnych wskaźników zapadalności na SARS-CoV-2 variants of concern (VOC) w Wielkiej Brytanii (UK), zespół oszacował, że 83,0% grupy pCF było zakażonych SARS-CoV-2 Alpha VOC. Wyniki TMS wykazały, że ułatwienie wewnątrzkorowe (ICF), miara wewnątrzkorowej funkcji glutamatergicznej, było znacznie niższe wśród pacjentów pCF niż w grupie kontrolnej (warunkowy motoryczny potencjał wywołany w stosunku do bezwarunkowego wynosił 171% w stosunku do 258%), wskazując na zmniejszoną pobudliwość korową. Pacjenci z pCF wykazywali zwiększony poziom zmęczenia obwodowego i większy czas reakcji wzrokowej. Maksymalny skurcz wywołany przez bezpośrednią stymulację elektryczną mięśni w następstwie trwałego skurczu mięśni wynosił 49% i 67% odpowiednio w pCF i w grupie kontrolnej. Wskazuje to, że pacjenci z pCF rozwijają zmiany metaboliczne we włóknach mięśniowych po długotrwałych działaniach, które skutkują obniżeniem wydajności siły. Pacjenci z pCF mieli normalną siłę chwytu, bez dowodów na zmęczeniowe przenoszenie w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) i normalną wewnętrzną pobudliwość motoneuronów. Średnie wartości spoczynkowej częstości akcji serca były znacząco większe wśród pacjentów z pCF niż w grupie kontrolnej (odpowiednio 75 versus 68 uderzeń na minutę). Przeciwnie, pacjenci z pCF mieli znacznie niższe wartości wysycenia krwi tlenem (SaO2) niż osoby z grupy kontrolnej (odpowiednio 95% versus 97%), prawdopodobnie z powodu trwałego uszkodzenia płuc i/lub waskulopatii. Wyniki badań wskazywały na obniżony ton wagalny (w stosunku do współczulnego) wśród pacjentów z pCF, wskazując, że co najmniej kilka osób z grupy pCF cierpiało na dysautonomię. Ponadto pacjenci z pCF mieli mniejszą zmienność HR, co wskazuje na zwiększoną aktywność współczulnego układu nerwowego. Habituacja galwanicznych odpowiedzi skóry na głośne (zaskakujące) dźwięki była również niższa u osób z pCF, co dodatkowo potwierdza nadmierną aktywność układu współczulnego. Ponadto pacjenci z pCF mieli podwyższoną temperaturę ciała, co wskazuje na długotrwały wpływ ostrego COVID-19 na aktywację immunologiczną i funkcję płuc i/lub uogólniony zwiększony napęd współczulny w pCF. Średnia dokładność klasyfikatora ML wynosiła 70,0%.