Połączenie fluwoksaminy i wziewnego budezonidu zmniejsza ciężki COVID-19 u pacjentów ambulatoryjnych wysokiego ryzyka

W najnowszym badaniu opublikowanym w Annals of Internal Medicine badacze przeprowadzili randomizowane, kontrolowane placebo badanie (RCT) wśród dorosłych z potwierdzonym zakażeniem koronawirusem 2 (SARS-CoV-2) zespołu ostrej niewydolności oddechowej z co najmniej jednym czynnikiem ryzyka ułatwiającym rozwój ciężkiej choroby, aby ocenić efekt leczenia skojarzonego fluwoksaminą i wziewnym budezonidem vs. placebo. W wielu badaniach II i III fazy wykazano, że fluwoksamina, selektywny inhibitor wychwytu zwrotnego serotoniny, i wziewny budezonid, kortykosteroid, mają korzystne profile bezpieczeństwa, wykorzystują w leczeniu działanie przeciwzapalne i zapobiegają progresji do ciężkiej choroby u pacjentów ambulatoryjnych z chorobą koronawirusową 2019 (COVID-19). Wszystkie te próby wykazały korzyści kliniczne tych dwóch leków samodzielnie, ale nie w połączeniu. Łączenie interwencji o udowodnionych korzyściach może poprawić skuteczność poszczególnych leków. Jest to istotne, ponieważ istnieje krytyczna potrzeba dostępnego i skutecznego leczenia wczesnego zakażenia SARS-CoV-2. Pacjenci ambulatoryjni COVID-19, dla których doustne inhibitory proteazy lub przeciwciała monoklonalne są niedostępne, najbardziej potrzebują tych terapii. W niniejszym badaniu zastosowano randomizowaną adaptacyjną próbę platformową w celu oceny potencjalnych dodatkowych korzyści z połączenia schematów doustnej fluwoksaminy i wziewnego budezonidu. W projekcie próby wykorzystano protokół główny, który określa kryteria decyzyjne dotyczące przerwania interwencji leczniczych z powodu daremności lub dodania nowych. Najpierw losowo przydzielono pacjentów ambulatoryjnych COVID-19 do grupy leczonej fluwoksaminą i budezonidem wziewnym lub do grupy otrzymującej jednocześnie placebo, stosując procedurę randomizacji blokowej w każdym z 12 uczestniczących ośrodków w Brazylii, stratyfikując uczestniczących w badaniu pacjentów według wieku na przedziały mniej niż 50 i więcej niż 50 lat. Warto zauważyć, że populacja badana była w ~95% zaszczepiona i dobrze zbilansowana pod względem wieku, chorób współistniejących i wskaźnika masy ciała. Ponadto zespół RCT, pracownicy ośrodka oraz wszyscy pacjenci pozostawali zaślepieni co do przydziału leczenia. Zespół RCT podawał fluwoksaminę w dawce 100 mg dwa razy dziennie i 800 mcg dwa razy dziennie oraz budezonid wziewny przez 10 dni. Rejestrowali podstawowy wynik przez 28 dni po randomizacji, stosując do analizy ramy Bayesa. Było to połączenie hospitalizacji związanej z COVID-19, zatrzymania na oddziale ratunkowym w celu obserwacji lekarskiej przez ≥sześć godzin oraz innych powikłań związanych z ciężkością choroby. Monitorowali również kilka wyników wtórnych, takich jak niepożądane reakcje na leki, śmiertelność i problemy zgłaszane przez pacjentów, aby wymienić tylko kilka. Badacze zastosowali podejście frequentystyczne do analizy wyników wtórnych. Wreszcie, zastosowali modele proporcjonalnych zagrożeń Coxa do oceny wyników czasowych. W obu grupach otrzymujących doustną fluwoksaminę plus wziewny budezonid i placebo było 738 uczestników. W wysoce zaszczepionej kohorcie otrzymującej doustną fluwoksaminę i wziewny budezonid stwierdzono znaczne zmniejszenie złożonego pierwszorzędowego punktu końcowego, jakim była hospitalizacja lub pobyt w izbie przyjęć przez ≥sześć godzin, co ilustruje ochronne działanie skojarzonego leczenia farmakologicznego we wczesnym etapie badania COVID-19. Budezonid podawany wziewnie wywierał swoje działanie poprzez interakcję w nabłonku płuc lub w wyniku biodostępności leku, w zależności od stanu pierwotnej odporności biorcy. Podejście badawcze pomogło zidentyfikować osoby będące pod obserwacją w warunkach ED przez sześć godzin z cięższymi objawami. W Brazylii, zatrzymanie pacjentów COVID-19 w specjalistycznych ustawieniach ED było równie ważne jak hospitalizacja, gdy liczba pacjentów ambulatoryjnych osiągnęła szczyt podczas fali pandemii. Pacjenci w tych ustawieniach reprezentowali tych, którzy doświadczyli pogorszenia klinicznego COVID-19, ale pozostali niehospitalizowani z powodu problemów z przepustowością szpitala. Inną cechą wyróżniającą to ambulatoryjne RCT było to, że obejmowało ono bezpośredni kontakt z pacjentem i późniejsze obserwacje za pośrednictwem telekomunikacji przez personel medyczny, pielęgniarki i klinicystów. Bezwzględna liczba poważnych zdarzeń niepożądanych w grupie stosującej leczenie skojarzone była niższa niż w grupie placebo. To odkrycie ma implikacje dla klinicznego zarządzania pacjentami ambulatoryjnymi z COVID-19 na całym świecie. Ponieważ te doustne leki są niedostępne w krajach o niskich i średnich dochodach, leki repurpose mogą być alternatywną opcją dla dostawców opieki zdrowotnej. Jednak nawet w Stanach Zjednoczonych Ameryki i krajach o wysokich dochodach, leki te pozostają zarezerwowane dla populacji osób starszych o wyższym ryzyku progresji do COVID-19.

Stwierdzono, że białko OCLN odgrywa kluczową rolę w transmisji SARS-CoV-2 z komórki do komórki

W najnowszych badaniach opublikowanych w czasopiśmie PNAS naukowcy wykazali, że białko TJ (ang. tight junction) - okludyna (OCLN) - jest krytyczne dla ciężkiego ostrego zespołu oddechowego koronawirusa 2 (SARS-CoV-2) przenoszonego bezpośrednio z komórki na komórkę wewnątrz gospodarza. Przeniesienie wirusa poprzez ścisły kontakt komórka-komórka zmniejsza skuteczność leków przeciwwirusowych i pomaga wirusom uniknąć neutralizujących przeciwciał (nAbs). Badania udokumentowały, że wiele ludzkich wirusów, w tym SARS-CoV-2, grypy A i oddechowego wirusa syncytialnego (RSV), wykorzystuje ten mechanizm, cząstki bezkomórkowe lub oba, aby ustanowić infekcję i przetrwać wewnątrz gospodarza. Poprzednie badania wiązały również tworzenie się syncytiów w tkankach ludzkich płuc z SARS-CoV-2. W przypadku SARS-CoV-2 i innych koronawirusów (CoV), np. bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS-CoV), tworzenie syncytiów przyczynia się do zwiększonej bezpośredniej transmisji komórka-komórka. Jednakże, czynniki gospodarza zaangażowane w ten proces i mechanizmy leżące u podstaw indukowanego przez glikoproteinę S rozprzestrzeniania się SARS-CoV-2 z komórki do komórki pozostają niejasne. Komórki nabłonkowe w ludzkich drogach oddechowych posiadają struktury międzykomórkowe zwane TJs, które regulują przepływ jonów i małych substancji stałych. Służą one również jako pierwsza bariera dla patogenów. TJs zawierają białko OCLN, uznawane za istotny czynnik gospodarza dla wejścia kilku wirusów do wnętrza ludzkiego gospodarza, np. rotawirusa i wirusa zapalenia wątroby typu C. Ponieważ indukowana przez wirus fuzja zakażonych komórek z sąsiednimi komórkami i tworzenie syncytiów wymaga przełamania bariery międzykomórkowej, badacze spekulowali, że białka TJ mogą być zaangażowane w rozprzestrzenianie się SARS-CoV-2 poprzez transmisję komórka-komórka. W obecnym badaniu naukowcy zbadali wpływ infekcji SARS-CoV-2 na białka TJ, co pomogło im odkryć wcześniej nieznaną rolę OCLN jako czynnika internalizacji pochodzącego od gospodarza dla wejścia SARS-CoV-2 i następującego po tym przeniesienia komórki do komórki w obrębie komórek gospodarza. Użyli komórek Vero-E6 zakażonych replikacyjnym, kompetytywnym wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (rVSV) wyrażającym wzmocnione zielone białko fluorescencyjne (eGFP) i SARS-CoV-2 S (rVSV-eGFP-S), lub alternatywnie, rekombinantem SARS-CoV-2 wyrażającym gen mNeonGreen, aby określić dystrybucję OCLN w zakażonych komórkach Vero-E6. Western blot potwierdził, że infekcje przez oba rekombinanty zmieniły ekspresję OCLN. Odpowiednio, poziomy OCLN stały się niewykrywalne 48 godzin po infekcji (pi) w zakażonych komórkach Vero-E6. Zespół potwierdził również te wyniki w komórkach A549-hACE2 pochodzących od człowieka oraz w modelu zakażenia SARS-CoV-2 u chomika. Następnie zespół ustalił, czy komórki permisywne, np. komórki Vero-E6 i A549-hACE2, również potrzebują OCLN do ustanowienia infekcji SARS-CoV-2. W tym celu transfekowano komórki Vero-E6 dwoma małymi interferującymi RNA ukierunkowanymi na OCLN (siRNA), co pomogło im potwierdzić ekspresję OCLN za pomocą testu immunofluorescencyjnego (IFA) i ilościowej reakcji łańcuchowej odwrotnej transkryptazy-polimerazy (RT-qPCR). Ponadto badacze przeprowadzili test koimmunoprecypitacji (co-IP) w celu uwidocznienia interakcji OCLN z białkiem SARS-CoV-2. OCLN jest białkiem transmembranowym z czterema domenami helikalnymi, viz., wewnątrzkomórkową domeną N-końcową, długim ogonem cytoplazmatycznym, znanym również jako C-końcowy, dwiema pętlami zewnątrzkomórkowymi, EL1 & EL2 połączonymi przez krótką pętlę wewnątrzkomórkową. Ostatecznie badacze ustalili więc, która domena OCLN była krytyczna dla internalizacji SARS-CoV-2 i przekazywania go z komórki do komórki. W tym celu zespół skonstruował cztery konstrukty delecji OCLN, viz., hOCLN/ΔC, hOCLN/ΔE1, hOCLN/ΔE2, i hOCLN/ΔN, i transfekował je do linii komórkowej OCLN KO Vero-E6. Następnie potwierdzili ekspresję każdego z nich za pomocą Western blot i IFA. Badanie wskazało, że OCLN, czynnik gospodarza, pośredniczy w internalizacji SARS-CoV-2 i następującej po niej transmisji komórka-komórka. Tak więc, jego knockdown zmniejszył rozprzestrzenianie się SARS-CoV-2, podczas gdy jego nadekspresja promowała go w eksperymentach z rVSVs wyrażających białka S wielu wariantów SARS-CoV-2. Zakażenie in vitro i in vivo SARS-CoV-2 wyraźnie zmniejszyło i ostatecznie całkowicie zniszczyło OCLN. Wszystkie rVSV wyrażające białka S wariantów SARS-CoV-2 Delta, Beta i Kappa wykazywały lepsze przenoszenie komórka-komórka niż szczep WA-1. Warianty Gamma i Alpha wykazywały porównywalną zdolność do tworzenia syncytium jak szczep WA-1. Co ciekawe, Omicron wykazywał wyraźnie zmniejszoną zdolność do tworzenia syncytiów w komórkach A549-hACE2 w stosunku do innych wariantów SARS-CoV-2 i WA-1, wskazując, że Omicron ma ograniczoną zdolność do rozprzestrzeniania się komórka-komórka przy użyciu ścieżki endocytarnej. Ta obserwacja uzasadnia również, dlaczego podlinie Omicron BA.1/BA.2 wywołują banalne objawy kliniczne niż WA-1 i inne warianty SARS-CoV-2. Ponadto, eksperymenty badawcze sugerowały, że infekcja SARS-CoV-2 degradowała tylko OCLN, ale miała minimalny wpływ na inne białka TJ, np. Claudin-1. W przyszłych badaniach należy zbadać mechanizmy leżące u podstaw indukowanego przez SARS-CoV-2 obniżenia syntezy i stabilności białka OCLN w TJ. W komórkach permisywnych SARS-CoV-2 knockdown OCLN nie wpływał na ekspresję enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2), ale wyraźnie zmniejszał infekcję wirusową, zwłaszcza podczas etapu internalizacji i następującej po nim replikacji wirusowej. Odwrotnie, jego nadekspresja znacznie zwiększyła zarówno internalizację i replikację SARS-CoV-2, ale nie jego wiązanie. Tym samym OCLN nie mógł być uznany za receptor lub coreceptor dla wejścia SARS-CoV-2. Wyniki badań ujawniły również, że ścieżka wejścia endosomalnego była zaangażowana w pośredniczone przez OCLN przenoszenie SARS-CoV-2 z komórki do komórki. Wreszcie, traktowanie trypsyną znacząco promowało przenoszenie SARS-CoV-2 z komórki do komórki i zwiększało wydajność wirusa w komórkach gospodarza, sugerując, że to zjawisko pomaga zachować zakaźność i zdolność do przenoszenia wirusa bardziej niż przenoszenie bez komórek.